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La esquistosomiasis continúa siendo una de las enfermedades parasitarias con mayor prevalencia en el mundo. En la esquistosomiasis causada por S. mansoni, los huevos de los gusanos helmintos desencadenan un proceso de inflamación ganulomatosa hepática con desarrollo de fibrosis que esta mediado por linfocitos T CD4+ específicos para los antígenos del huevo (SEA). En el modelo murino de la enfermedad, los ratones de la cepa CBA desarrollan alta patología caracterizada por granulomas grandes y una pronunciada respuesta de linfocitos T hacia el SEA, mientras que los ratones de la cepa BL/6 desarrollan baja patología con granulomas de tamaño significativamente menor y una respuesta más atenuada de linfocitos T. En la fase aguda de la enfermedad en ambas cepas se desarrolla una respuesta de citoquinas del tipo Thl. Sin embargo, en el transcurso de la fase crónica se observa una respuesta combinada de citoquinas Thl/Th2 en los ratones de la cepa CBA, mientras que en los ratones de la cepa BL/6 la respuesta de citoquinas se polariza hacia una del tipo Th2. Los experimentos que se describen a continuación se realizaron con el fin de investigar cómo el ambiente de citoquinas, la apoptosis de los linfocitos T CD4+ y los mecanismos de coestimulación influyen el desarrollo de la inmunopatologia inducida por los huevos en el modelo murino de la infección con esquistosoma y sus consecuencias en la enfermedad. l. Se usó un modelo artificial de alta patología producido por la inmunización de ratones BL/6 con SEA en adyuvante completo de Freund (CFA) para estudiar el papel de las respuestas de citoquinas del tipo Thl vs. Th2 en el desarrollo de la inmunopatologia. Los resultados mostraron que la inmunización con SEA/CFA indujo un cambio en la producción de citoquinas hacia un perfil Thl por una población numéricamente estable de linfocitos T CD4+ específicos para el SEA que se correlacionó con una cxacerbación grave de la inmunopatologia y con la muerte prematura de los ratones. 2. Se estudiaron el papel de la apoptosis de linfocitos T CD4+ en el desarrollo de la inmunopatologia y el posible mecanismo inductor de este tipo de muerte celular comparando varios parámetros inmunológicos relacionados con los linfocitos T CD4+ entre las dos cepas de ratones polares, CBA y BL/6. Los resultados demostraron que la apoptosis de linfocitos T CD4+ de los granulomas y de los ganglios linfáticos mesentéricos (GLM) fue más elevada en la cepa de baja patología BL/6 que en la cepa de alta patología CBA como consecuencia de la falta de producción de la IL-2. El tratamiento in vivo de los ratones BL/6 con lL-2 recombinante resultó en un aumento de la patología hepática y una disminución de la apoptosis de linfocitos T CD4+. 3. Finalmente, se examinó el papel del mecanismo ICOS-B7RP-l (coestimulador inducibleproteína-l relacionada a B7) en el desarrollo de la inmunopatologia por medio del tratamiento de ratones BL/6 infectados con un anticuerpo monoclonal (AcMo) que bloquea a ICOS. Los resultados mostraron que el sistema de coestimulación ICOS-B7RP-l ayuda principalmente a controlar la producción de IFN-γ por linfocitos T específicos para el SEA y así promover un ambiente de citoquinas Th2 que lleva a limitar el daño hepático en la cepa de baja patología BL/6. Estos hallazgos contribuyen a nuestro conocimiento de los mecanismos que regulan la respuesta inmune en la esquistosomiasis murina. Ellos proveen nuevas evidencias de cómo los linfocitos T CD4+ regulan la inmunopatologia, confirmando que el establecimiento de un ambiente de citoquinas del tipo Th2 se correlaciona con la protección hacia esta infección por helmintos y que la apoptosis es un mecanismo para controlar los linfocitos T CD4+ que median la inmunopatologia. Los resultados presentados en esta tesis podrían ser utilizados para diseñar e implementar estrategias que resulten en un mejoramiento general de la inmunopatologia asociada con la enfermedad.

Mecanismos de Interacción en Proteínas Intrínsicamente Desordenadas Las Proteínas Intrínsecamente Desordenadas (IDPs, del inglés Intrinsically Disordered Pro- teins) desafían el dogma de la Biología Molecular en cuanto no poseen una estructura tridimensional definida en solución y entonces se desdibuja la relación estructura-función, al menos como ha sido definida hasta el momento. Estas proteínas no se comportan como estructuras tipo random coil, sino que uctúan entre variedad de conformaciones que dependen de cada sistema. Se ha predicho que al menos el 30% de las proteínas eucariotas son IDPs o tienen al menos un dominio que es intrínsecamente desordenado. Esto ha aumentado el interés por estas proteínas y su estudio se ha incrementado en las últimas dos décadas, mostrando que cumplen procesos celulares clave, como ser en el ciclo celular. En esta tesis se estudiaron diversos sistemas que involucran a Proteínas Intrínsecamente Desordenadas. En el sistema p53TAD/CBP estudiamos los cambios producidos en el estado unido del complejo ante modificaciones post-traduccionales y las posibles implicancias en los mecanismos de unión/plegado. En el sistema c-myb/KIX estudiamos el mecanismo de unión/plegado, y logramos caracterizar con detalle atómico al estado de transición. Finalmente, se desarrolla un potencial de interacción electrostática para un campo de fuerzas de grano grueso tipo Go, que se prueba en dos sistemas modelo de proteínas ordenadas y se analiza en los sistemas c-myb/KIX y pKID/KIX los efectos de carga sobre la reacción de unión/plegado. Para realizar el trabajo planteado se recurrió a diversas herramientas computacionales. Se utilizaron los programas GROMACS y AMBER para realizar dinámicas moleculares con campos de fuerza atomísticos y de grano grueso. Se realizaron modificaciones en el programa AMBER para utilizar campos de fuerza de grano grueso. Se utilizaron además paquetes académicos de análisis computacional y de cálculo de ΔΔG de binding para experimentos mutacionales de unión entre proteínas.

El mecanismo de las reacciones de sustitución nucleofílica aromática (SNA)entre sustratos activados y aminas en solventes apróticos no polares, no ha sido, hasta el momento, debidamente elucidado. Poca atención ha merecido, también, la influencia ejercida por grupos voluminosos vecinos al centro de reacción. Con el doble propósito de investigar a) el mecanismo de estas reacciones en solventes de baja constante dieléctrica y b) el efecto ejercido por sustituyentes con considerables requerimientos estéricos (-NO2; -Br; -CH3) próximos al centro de reacción, se han estudiado en la presente Tesis, las reacciones de 4-R- y 6-R-2-nitroanisoles con diversas aminas tales como:ciclohexilamina, n-butilamina, piperidina y N-metilpiperidina en benceno y/o ciclohexano. La elección de estos sustratos se basó en la caracteristica de nucleófugo pobre del grupo metoxilo, muy poco estudiado además, en solventes no polares. Los nitrofenil-alquil-éteres son particularmente adecuados para investigar la catálisis básica por el nucleófilo en las reacciones de SNA,ya que usualmente en las reacciones de estos compuestos la ruptura del complejo intermediario es el paso determinante de la velocidad. Estas reacciones, sin embargo, no son tan simples debido a un proceso lateral de sustitución nucleofílica alifática (SN2)por el cual se rompe la unión O—metilo de los éteres, lo que conduce a la formación de los fenoles correspondientes. Los sistemas estudiados, son, por lo tanto, apropiados para investigar la competencia entre las reacciones de SNAy SN2. En la presente Tesis se realizó el estudio cinético de 2,4- y 2,6-dinitroanisol con piperidina en benceno a diferentes temperaturas y varias concentraciones de la amina, a fin de determinar la importancia del paso base catalizado en la descomposición del compuesto intermediario, como así también, la influencia ejercida por los grupos nitro operando desde las posiciones orto. En la reacción de 2,4-dinitroanisol con piperidina en benceno, los procesos de SNA y SN2 ocurren con velocidades semejantes, siendo la reacción de SNA acelerada suavemente por la amina, lo cual encuadra dentro de los casos de pequeñas aceleraciones descriptos por Bunnett. En la reacción de 2,6-dinitroanisol con piperidina, en cambio, hemos observado en todos los casos que la demetilación es entre 5 y 20 veces más rápida que la reacción de SNA. La velocidad del proceso de SNA para el 2,6-dinitroanisol es alrededor de 10 veces mayor que para el 2,4-dinitroanisol, lo que es interpretado en términos de un aumento de velocidad del paso no catalizado, k2 (ec. 2). Si bien es interesante la mayor reactividad del 2,6- frente al 2,4-dinitroanisol para la SNA, más natorio es el aumento en las velocidades de SN2. Las mediciones cinéticas permiten establecer que las velocidades de demetilación para el isómero 2,6- son 1000 y 300 veces más rápidas, con piperidina y N-metilpiperidina, respectivamente, que las del 2,4-dinitroanisol. Para explicar este fenómenose ha calculado el efecto de campo ejercido por el grupo nitro desde la posición orto. El cálculo de las temperaturas isocinéticas permite concluir que el proceso de sustitución nucleofílica aromática estará favorecido frente al de sustitución alifática, a más bajas temperaturas y a mayores concentraciones de la amina. Esta es una generalización sumamente útil que permite el control de ambos procesos al planear la sintesis de los productos de SNA a partir de los respectivos anisoles. Por otro lado, trabajando con aminas primarias, los productos de demetilación se detectaron sólo a baja concentración de amina ( <0,1 M), esto es consecuencia de la notable aceleración de las reacciones de SNA al aumentar la concentración de aquélla. Al estudia las reacciones de 2,4- y 2,6-dinitroanisol con ciclohexilamina en benceno hemos encontrado, sorprendentemente, una relación cuadrática, entre la constante de velocidad de segundo orden, kA, y la concentración de base como se muestra en las fig. 5 y 7. Este comportamiento anómalo es irreconciliable con el mecanis moconocido hasta el momento para las reacciones de SNA. Trabajos previos de otros investigadores muestran un comportamiento similar, siempre en solventes apróticos no polares como benceno, tolueno e isooctano. Estos resultados no fueron interpretados mecanisticamente y el apartamiento del comportamiento esperado fue atribuido a un efecto inespecífico del solvente. Sin embargo, si se divide cada constante de velocidad de segundo orden por la concentración de amina, y los cocientes se grafican en función de esta última se observa una dependencia lineal (fig. 6 y 8). Esto indica que se trata de cinéticas de tercer orden respecto de la concentración de la amina. En 1981, Banjoko publicó resultados similares trabajando con 2,4,6-trinitrofenil-fenil-éter y anilina en benceno, y los explicó haciendo intervenir una tercera molécula de amina en el paso base catalizado. Su mecanismo,y las ec. cinéticas derivadas de él, no se ajustan, sin embargo, a nuestros resultados, ya que como puede observarse en las figuras 6; 10 y 12 para las reacciones desarrolladas a 60°C, se obtiene una meseta para altas concentraciones de la amina, lo cual no es predecible por el mecanismo mencionado. Estas y otras evidencias discutidas en la presente Tesis descartan el mecanismo propuesto por Banjoko. Es sabido que en solventes de baja constante dieléctrica, tanto las aminas alifáticas como aromáticas, se encuentran parcialmente auto asociadas formando dimeros. En el Esquema 5 proponemos un mecanismo para las reacciones de SNA donde el dimero de la amina compite con el monómero para llevar a cabo el ataque nucleofIlico. Este mecanismo conduce a ecuaciones cinéticas que se ajustan a las expresiones de velocidad halladas experimentalmente, en la presente Tesis y en otros trabajos de la literatura. A fin de investigar la generalidad del mecanismo propuesto se estudiaron otras reacciones de SNA en donde se varió: el sustrato, el nucleófilo y el solvente. Se realizó el estudio cinético de las reacciones de 2,4- y 2,6 dinitroanisol con n-butilamina en benceno, hallándose resultados que se encuadran dentro del esquema propuesto (fig. lO y ll). Además, en la reacción de 2,4-dinitroanisol se encontró que la velocidad de reacción disminuye al aumentar la temperatura. Este poco común efecto inverso de la temperatura halla su explicación en el mecanismo propuesto, ya que la autoasociación de las aminas decrece con el aumento de la temperatura. Un efecto inverso similar se detectó en las reacciones de ambos dinitroanisoles con ciclohexilamina en ciclohexano (fig. 12Y 13). Según lo determinado por Bernasconi y Zollinger, la reacción de 2,4-dinitrofluorbenceno con p-anisidina en benceno no se ajusta al mecanismo clásico; esto fue interpretado nuevamente en términos de un efecto del medio. La misma, sin embargo, responde al mecanismo propuesto véa el dímero. Se estudió entonces, la reacción de este sustrato con o-anisidina en benceno, a fin de comparar los resultados con los hallados por Bernasconi.En todos los casos se ha hallado que la reacción es de tercer orden respecto de la concentración de o-anisidina. (fig. 20 y 21) El efecto del agregado de una segunda especie básica catalizadora, tal como la piridina, tampoco se ajusta al mecanismo conocido, para la mencionada reacción con p-anisidina. De acuerdo con este me canismo la pendiente de la correlación lineal kA vs.la concentración de piridina,[P] , debe ser independiente de la concentración de anisidina; no obstante,se encontró que ésta aumentaba al aumentar la concentnación de la amina primaria, pero este resultado no fue interpretado por sus autores en términos mecanísticos. En la presente Tesis se estudió también el agregado de piridina en la reacción de 2,4-dinitrofluorbenceno con o-anisidina con el objeto de demostrar que existe una relación lineal entre la pendiente de la correlación kA vs.[P] y la concentración de o-anisidina, tal comolo predice el mecanismo del Esquema 6, donde se hace intervenir al dímero mixto entre ambas amina: como tercera especie nucleofílica. La fig. 23 muestra que existe la dependencia mencionada. Experiencias previas desarrolladas en nuestro laboratorio (J. Chem.Soc. Perkin Trans. II, 1256 (1976)) indicaban que la reacción de 2,4-dinitroanisol y ciclohexilamina en metanol no estaba catalizada por la amina. Resultado que es muy diferente al descripto aqui, trabajando en benceno. Por lo tanto, resultó de gran interés estudiar el comportamiento de este tipo de sistemas en mezclas de benceno metanol. Si se admite la hipótesis de la intervención del dímero en benceno y que en metanol opera el mecanismo clásico, en mezclas va riables de benceno-metanol debe observarse alguna manifestación del cambio de mecanismo, si éste verdaderamente ocurre. En la reacción de 2,6-dinitroanisol con ciclohexilamina se observó un pronunciado descenso de la velocidad de reacción por el agregado de pequeñas cantidades de metanol. Esto está de acuerdo con la disminución en la concentración del dímero de la amina, (la asociación de las moléculas de amina con el metanol es un proceso más favorecido, como se ha probado termodinámica y teóricamente). Luego la velocidad aumenta al aumentar la proporción de metanol siendo el nucleófilo, en esas condiciones, el monómero de la amina. Los efectos de los grupos vecinos al centro de reacción en la SNA han sido objeto sólo de unos pocos estudios sistemáticos. En la presente Tesis se discuten los factores que afectan las velocidades y mecanismos de reacción encuadrados dentro de los llamados efectos orto o efectos de proximidad. Las reacciones de 4-R- y 6-R-2-nitroanisoles (R= —CH3;—Br) con piperidina y ciclohexilamina son sumamente lentas para hacer un estudio sistemático de catálisis básica. Se investigó, en consecuencia, la diferencia de reactividad de estos sustratos trabajando en soluciones de las aminas puras. Las reacciones con ciclohexilamina conducen exclusivamente a la formación de los productos de SNA correspondientes, siendo todos ellos productos no descriptos; mientras que las desarrolladas con piperidina producen fundamentalmente los respectivos nitrofenoles. Este comportamiento diferencial puede atribuirse a los mayores requerimientos estéricos de la amina secundaria para llevar alcabo el ataque sobre el átomo de carbono del anillo aromático. En todos los casos se ha hallado que los 6-R-2-nitroanisoles son más reactivos que los correspondientes 4-R-2-nitroanisoles. Esto indica la ausencia de efectos estéricos primarios. La mayor reactividad de los isómeros con dos sustituyentes en las posiciones orto se interpreta en términos de un efecto estérico secundario que obliga a los 6-R-2-nitroanisoles a adoptar una conformación donde el grupo metoxilo no es coplanar con el anillo. Esto está avalado por los cálculos mecano-cuánticos efectuados por los métodos CNDO/2 e INDO para diferentes conformaciones de los nitroanisoles mencionados. Nuestros estudios, como así también otros espectroscópicos, cristalográficos y teóricos, indican que, en ausencia de requerimientos estéricos importantes, el grupo metoxilo de los anisoles adopta una conformación coplanar con el anillo aromático. Por el contrario, cuando este grupo está flanqueado por sustituyentes voluminosos adopta una conformación no coplanar, como se indica en la fig. 30, (conformaciones PIl y PI2).

Fil:Socolovsky, Susana Emilia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La anemia que padecen los pacientes con insuficiencia renal crónica (IRC) terminal resulta de la convergencia de múltiples factores. Entre ellos, escasa síntesis de eritropoyetina (Epo), presencia de sustancias que deprimen la eritropoyesis y pérdida de sangre durante la diálisis y por el tracto gastrointestinal. La intoxicación por aluminio (Al) de pacientes que reciben medicamentos que contienen al catión puede producir, o incluso empeorar, la anemia preexistente. El propósito del presente trabajo es explorar si las sustancias acumuladas en el plasma de pacientes con IRC inhiben la eritropoyesis y establecer el grado de participación del Al en ese proceso de inhibición. Los resultados alcanzados señalan que los pacientes con IRC poseen un número adecuado de progenitores eritroides tardíos (CFU-E), células que, aisladas del entorno urémico, responden normalmente a1 estímulo por Epo. En el plasma de estos pacientes existen sustancias (PM>10 kDa) que interrumpen el desarrollo de CFU-E, pero que no modifican el PM de las proteínas de la membrana de los glóbulos rojos. La electroforesis de estas proteínas muestra perfiles similares entre los pacientes y los individuos con función renal normal (FRN). Algunos mecanismos de acción del Al pueden ser conocidos a través de las experiencias realizadas in vitro. El Al³+ es captado por las células eritroides sólo cuando está unido a transfenina (Tf), no desplaza al Fe³+ ya unido a Tf e inhibe el desarrollo de CFU-E si existen sitios de unión vacantes en la molécula de Tf. La inhibición ocurre en presencia de Epo en estadios tempranos de la estimulación celular, no es anulada por mayores concentraciones de Epo o de Ca²+ y depende del compuesto de Al. El estudio de la acción del Al sobre la eritropoyesis in vivo muestra que la sobrecarga oral con 0,5 μmol Al/g peso/día durante 2 semanas, induce la inhibición del desarrollo de CFU-E in vitro, en ratones con FRN. La sobrecarga durante 22 semanas provoca, además, la disminución del hematocrito (Hto) y de la hemoglobina (Hb), correlación negativa entre la concentración plasmática de Epo y el Hto y disminución de la fragilidad osmótica de los eritrocitos circulantes. La administración de 1 μmol Al/g peso/día durante 102 días a ratas con FRN provoca aumento de la concentración sérica de Al y moderada inhibición del desarrollo de CFU-E. Mayores dosis de Al inducen la disminución del Hto y la Hb, el aumento de la resistencia osmótica, el acortamiento de la vida media eritrocitaria y la acumulación ósea de Al. En ratas con IRC, se observa aumento de la concentración de Al en suero, cerebro y hueso, así como una marcada inhibición del desarrollo de CFU-E. En síntesis, el Al resulta tóxico para las células eritroides cuando la acumulación intracelular está favorecida. La liberación lenta desde un compartimiento profundo que lo ha acumulado (tejido óseo), puede derivar en una exposición endógena prolongada de las células eritropoyéticas en la médula ósea y favorecer la aparición de signos de anemia. Palabras claves: insuficiencia renal crónica, anemia, toxinas urémicas, eritropoyesis, inhibición de CFU-E, aluminio, toxicidad del aluminio, acumulación tisular de aluminio.

La Fiebre Aftosa es la enfermedad viral del ganado que mayor impacto económico ocasiona a la Argentina, no sólo por los perjuicios directos a las especies afectadas, sino también por las pérdidas indirectas debido al cierre de mercados de exportación que representarían ingresos de divisas para nuestro pais. El principal elemento utilizado en la lucha contra esta enfermedad es la inmunización preventiva, pero la principal limitante de los inmunógenos en uso es la corta duracion de la inmunidad que confieren. Existe gran cantidad de información sobre la epidemiología de la enfermedad y la biología del virus. Sin embargo, es muy poco lo que se conoce sobre la relacion virus-huesped y su respuesta inmune. El proposito de este trabajo es abordar el problema desde el otro elemento de la ecuacion epidemiológica, el huesped, y tiene como objetivo considerar los mecanismos de respuesta inmune específica que el hospedador pone en funcionamiento frente a la inmunización con virus activo e inactivado. Se seleccionó un modelo murino de infección al virus de la Fiebre Aftosa por lo detallado del conocimiento que se posee sobre el sistema inmune del ratón, la posibilidad que brinda este animal de manipular sus poblaciones celulares inmunocompetentes in vivo y la experiencia ganada en investigaciones previas realizadas en nuestro laboratorio. Se determinó que en el modelo murino experimental, existe una correlación entre el nivel de anticuerpos a-VFA inducido por el virus activo o el virus inactivado y el grado de protección conferido. Sin embargo, la duración de la inmunidad producida por la infección en ratones atímicos y eutímicos es prolongada mientras que la producida por la inmunización con 0.1 μg del virus inactivado es de corta duración. Esta diferencia en la duración de la inmunidad no es atribuible a persistencia viral. Se observó un cumportamiento diferencial del sistema inmune del ratón en la respuesta a ambos inmunógenos: En centraposición a lo que ocurre cuando se transfieren celulas B purificadas provenientes de dadores inmunizados con VA a receptores singeneicos irradiados e infectados (Borca, M. et al,1986), las células B provenientes de dadores inmunizados con VI no son capacez de eliminar la infección en los ratones reconstituldoe pero sí lo son las células totales de bazo provenientes de los mismos dadores. El agregado, a las celulas B, de una pequeña proporción de células T provenientes de las mismos dadores inmunizados con VI, sirve para acortar la viremia provocada por la infección de los receptores. El virus activo se comportaría como un antígeno timo-independiente "optativo", mientras que el Virus inactivado se comportaría como un antígeno timo-dependiente típico. Estos resultados se consideran relevantes para la elaboracion de vacunas anti-aftosa formuladas con inmunomoduladores que permitan mimetizar la respuesta del virus inactivado con la inducida por el virus activo, con el objeto de lograr una mejor y mas duradera inmunidad.

Tesis (Dra. Medicina)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Médicas

La Terapia Fotodinámica (TFD) es utilizada para el tratamiento del cáncer y otras patologías no malignas. Se basa en la administración un compuesto fotosensibilizante (FS) que se acumula selectivamente en el tejido maligno y al recibir luz de longitud de onda adecuada, éste interactúa con el O2 produciendo especies reactivas del oxígeno (ROS), que son altamente tóxicas y desencadenan la muerte celular. La administración exógena del ácido 5-aminolevúlico (ALA), precursor biológico de la síntesis de los tetrapirroles, induce la acumulación de protoporfirina IX (PpIX), el único FS endógeno. En la erradicación de tumores mediante TFD intervienen diferentes procesos de muerte celular, los que incluyen apoptosis, necrosis, y autofagia. En el presente trabajo se estudiaron los mecanismos que llevan a la muerte celular por TFD basada en ALA en células de adenocarcinoma de pulmón humanas (A549) cultivadas de modo convencional -en monocapa- o en esferoides multicelulares (EMCs, agregados celulares compactos que desarrollan gradientes de nutrientes y oxígeno), y en una variante resistente derivada mediante sucesivos ciclos de tratamiento fotodinámico y recuperación. La acumulación de PpIX a partir de ALA aumentó con el tiempo de incubación y la concentración de ALA hasta alcanzar un plateau con 1 mM tanto en monocapas como en EMCs. Estudios de microscopía confocal indicaron que las mitocondrias son el principal sitio de localización de PpIX endógena pero no de PpIX administrada exógenamente, la cual se localiza en la membrana plasmática. Los EMCs presentaron una capacidad de síntesis de PpIX similar a las células en monocapa, mientras que en células resistentes se observaron niveles menores de acumulación. La TFD-ALA reduce significativamente la supervivencia celular de manera dosis lumínica dependiente aunque en menor medida tanto en células resistentes como en EMCs. La TFD-ALA induce en las células la generación de ROS tales como ¹O2, O2ֿ y peróxidos, en células en monocapa pero no en EMCs; y esa producción puede ser modulada por agentes antioxidantes de alto grado de protección como el ascorbato y el trolox, con un consecuente aumento en la viabilidad celular. Se observaron eventos asociados a apoptosis 1 h luego de la TFD: reducción del tamaño celular, irregularidades en la membrana plasmática, condensación de la cromatina, despolarización de la membrana mitocondrial, liberación de citocromo c al citoplasma, externalización de fosfatidilserina y activación de caspasa-3. En cambio, tanto en EMCs como en células resistentes se observó una reducción notable en la producción de ROS y en los parámetros de apoptosis. Por otro lado, en todos los casos se hallaron indicios de un proceso autofágico, caracterizado por la formación de vacuolas de doble membrana y la detección de LC3-II, así como la expresión de la proteína antiapoptótica Bcl-2. La activación del factor nuclear NFκB únicamente se halló en células tratadas con dosis bajas de TFD, mientras que las células resistentes mostraron presencia de este factor en el núcleo en todos los tiempos de irradiación, de manera creciente. Los resultados obtenidos en este trabajo permiten determinar que los mecanismos de muerte celular post-TFD ocurren principalmente por la vía apoptótica intrínseca, pueden ser modulados por agentes antioxidantes, y coexisten con procesos autofágicos. Por otro lado, el modelo de EMCs es más adecuado para el estudio de los efectos de la TFD-ALA respecto de la monocapa, ya que simula la estructura de microtumores avasculares y refleja características histológicas como la secreción de mucopolisacáridos y la expresión del factor inducido por hipoxia (HIF1-α). La autofagia es el mecanismo principal de respuesta a TFD en células resistentes, las cuales a su vez incrementan mecanismos de sobrevida como la activación de NFκB. Estos son factores condicionantes de la eficacia del tratamiento a considerar al aplicar TFD repetidamente en el tratamiento de tumores y al emplear agentes antioxidantes para minimizar el fotodaño a tejidos no tumorales.

Los seres humanos han colonizado gran parte de los ecosistemas de la Tierra, lo que ha conllevado a una progresiva modificación de los ambientes naturales. La urbanización del medio es un caso particularmente drástico de modificación del hábitat en la que la mayoría de las especies no logran persistir. Sin embargo, muchas de ellas son capaces de adaptarse a estos nuevos entornos e incluso prosperar exitosamente, volviéndose muchas veces más abundantes que en los entornos rurales. Este escenario ha generado un interés creciente en comprender cuáles son los procesos y mecanismos implicados en la colonización exitosa de los hábitats urbanos, así como los costos y beneficios derivados de ésta. La Lechucita de las Vizcacheras (Athene cunicularia) es una pequeña ave rapaz que se distribuye a través del continente americano, donde muestra diferentes tendencias poblacionales. Mientras que en el hemisferio norte la pérdida de hábitat, sumado a otras amenazas, ha llevado a la disminución de sus poblaciones, en el hemisferio sur es una especie frecuente que habita ambientes naturales, semi-naturales y urbanizados. En esta tesis se presentan los resultados de un estudio a largo plazo de una población de Lechucita de las Vizcacheras en la ciudad de Bahía Blanca y en los alrededores rurales que la circundan. El seguimiento de la población se realizó mediante la captura y marcaje de los individuos, tanto en áreas urbanas como rurales. Este marcaje permitió estimar tanto parámetros demográficos (fundamentalmente supervivencia y productividad), así como estimadores fisiológicos con el fin de determinar los costos y beneficios de la ocupación de ambientes urbanos. Los objetivos de esta tesis fueron: 1) evaluar la selección de hábitat de reproducción de la especie teniendo en cuenta la disponibilidad de ambientes naturales y urbanizados, 2) analizar la respuesta al estrés a largo plazo en individuos urbanos y rurales, evaluando su relación con la eficacia biológica de los individuos en ambos ambientes, y 3) comparar los parámetros demográficos de la especie (supervivencia, éxito reproductivo, productividad), teniendo en cuenta la dispersión de los individuos entre hábitats. Los resultados indican que la liberación de depredadores que se produce en ambientes urbanos (menor riqueza y abundancia de depredadores que en ambientes rurales) podrían explicar la selección positiva de este hábitat por parte de la especie, así como la mayor densidad de parejas reproductoras frente a las observadas en el hábitat más natural. Pese a las diferencias en las condiciones ecológicas existentes entre los medios urbanos y rurales, los individuos urbanos no mostraron mayores niveles de estrés crónico que sus conespecíficos rurales. Esto sugiere que la vida en la ciudad no constituye una fuente de estrés adicional para los organismos. Más aún, los individuos adultos alcanzaron valores de supervivencia mayores en estos hábitats comparados con los individuos rurales, algo que no se observó en individuos juveniles, cuya supervivencia en medios urbanos y rurales no fue estadísticamente diferente. La diferente supervivencia de los individuos adultos en uno y otro medio evidenció una relación cuadrática entre los niveles de estrés y la supervivencia de los individuos, con mayores mortalidades en individuos con bajos y altos niveles de corticosterona en pluma. Finalmente, también se encontraron diferencias en los parámetros reproductivos de los individuos urbanos y rurales, con valores medios superiores para el caso de los primeros. Cabe destacar la interacción existente entre hábitat y años, que evidencia la estabilidad de los valores de productividad para el caso de los individuos urbanos frente a las fluctuaciones observadas en los rurales. En resumen, los resultados sugieren que las ciudades tienen una papel de conservación importante para las especies que son capaces de colonizarlas exitosamente, algo fundamental cuando consideramos especies cuyos hábitats naturales se encuentran amenazados o en declive, como es el caso de los pastizales templados.

La radiación UV es la porción más energética del espectro solar que alcanza la superficie terrestre. Este tipo de radiación y, en mucha menor proporción, la luz visible, son capaces de modificar la estructura química de ciertas macromoléculas y metabolitos presentes en los tejidos. En particular, los cambios químicos sufridos por las proteínas y por el ADN producen graves consecuencias a nivel celular. Dichos efectos van desde disfunciones en el metabolismo celular hasta la muerte, pasando por la generación de mutaciones en la secuencia de bases del ADN. La formación de mutaciones puede conducir a la proliferación sin control de la célula con la consiguiente generación de un proceso neoplásico en el tejido que la contiene. Existen dos grupos de mecanismos mediante los cuales la radiación electromagnética modifica o daña al ADN. Los procesos directos se inician con la absorción de fotones por las bases nitrogenadas que son los cromóforos del ADN. Estos procesos ocurren normalmente con una frecuencia muy baja porque el tipo de radiación que absorben las bases nitrogenadas es filtrada en su mayor parte por la atmósfera y sólo llega a la superficie de la Tierra una porción muy pequeña. El otro grupo de procesos fotoquímicos que dañan al ADN y otras macromoléculas son indirectos. En los mismos, un segundo compuesto, denominado fotosensibilizador o simplemente sensibilizador, absorbe la radiación y genera estados electrónicamente excitados, los cuales desencadenan reacciones que involucran al ADN y otros componentes celulares. La radiación de tipo UV-A (320-400 nm) y visible no es filtrada por la atmósfera y puede, por consiguiente, ser absorbida por diversos fotosensibilizadores, por lo cual la protección de la capa de ozono no evita este tipo de reacciones. A partir del descubrimiento, relativamente reciente, de estos procesos fotosensibilizados, se inició la búsqueda y estudio de compuestos que pudieran actuar como fotosensibilizadores. La investigación en este campo persigue varios objetivos. Por un lado, la identificación de sensibilizadores permite evitar la exposición a los mismos. Por otro lado, se pretende entender mejor los mecanismos implicados en la generación de procesos neoplásicos provocados por la radiación solar. Por último, se han desarrollado diversas aplicaciones basadas en el uso de fotosensibilizadores, como sistemas de esterilización y técnicas de terapia fotodinámica. En la actualidad se sabe que varios grupos de compuestos heterocíclicos naturales se comportan como fotosensibilizadores, entre los que se encuentran las pterinas. Las pterinas son una amplia familia de compuestos con estructuras químicas, propiedades fisicoquímicas y funciones biológicas muy variadas. En particular las pterinas oxidadas son fotosensibilizadores eficientes, capaces de actuar a través de diferentes mecanismos como son la producción de especies reactivas de oxígeno y procesos de transferencia electrónica. Se ha demostrado que pterina, el compuesto modelo no sustituido de esta familia, es capaz de modificar a través de procesos fotosensibilizados ADN, nucléotidos, proteínas, péptidos y aminoácidos. Las pterinas más importantes desde el punto de vista biológico son las tetrahidropterinas que no son fotoquímicamente activas, mientras que las oxidadas no están presentes en los mamíferos en condiciones fisiológicas. Sin embargo, se acumulan en la piel de los seres humanos que sufren de vitiligo, una enfermedad cutánea que cursa con una interrupción en la síntesis de melanina, causando manchas blancas en la piel. En esta enfermedad la protección de la piel contra la radiación UV falla debido justamente a la falta de melanina. Por lo tanto, la fotoquímica y las propiedades fotosensibilizadoras de las pterinas adquieren particular interés para la comprensión del mecanismo de esta enfermedad. El principal objetivo de este trabajo de tesis es dilucidar los mecanismos implicados en la oxidación fotoinducida de los componentes del ADN por pterinas oxidadas en solución acuosa, bajo irradiación UV-A. Para ello se trabajó con derivados pterínicos presentes en piel de pacientes con vitiligo, biopterina (Bip), 6-formilpterina (Fop) y 6-carboxipterina (Cap), y con pterina (Ptr) como fotosensibilizador modelo. Como sustratos se emplearon dos nucleótidos púricos, 2’-desoxiadenosina 5’-monofosfato (dAMP) y 2’-desoxiguanosina 5’-monofosfato (dGMP), y uno pirimidínico, 2’-desoxitimidina 5’-monofosfato (dTMP).